本文阐述了非洲猪瘟病毒（ASFV）的微量血细胞吸附试验。与在莱顿管（Leightontube）中使用血沉棕黄层培养物的传统方法相比，这种试验方法同样灵敏，反应速度更快。该方法对猪血和试验空间的需求都更少。针对适合在绿猴肾细胞（VEROcells）中生长的ASF病毒的噬斑试验所测得的滴度与用微量血细胞吸附试验获得的滴度相似。微量试验和噬斑试验均表明，感染可由单个感染性颗粒产生。
简介
滴定ASF病毒的标准方法是基于猪红细胞（RBC）对受感染白细胞的吸附(Hess和DeTray，；Malmquist和Hay，；Malmquist，；Tubiash，；Haag和Larenaudie，)。这种试验方法灵敏且具有特异性，但和使用莱顿管中进行的传统试验一样耗时，而且需要大量的猪血沉棕黄层。我们根据Robb和Martin()使用的微量方法，开发了一种精细标准化的微量血细胞吸附试验方法。Greig（）最近发表了一种使用猪骨髓培养物的微量方法。
对于ASF病毒的遗传学研究，进行噬斑试验是有用的。到目前为止，ASF病毒噬斑试验只能用于滴定细胞培养适应性毒株（Parker和Plowright,）。本文描述了ASF病毒在VERO细胞中的生长适应性和该细胞系的噬斑试验，该试验与猪巨噬细胞的微量血细胞吸附试验一样灵敏。
方法
材料和试剂。组织培养所用的塑料微量I和II培养板以及培养皿，十分之一刻度的0-5ml微量注射器（Luertip）、针头和重复分液器按照Robb和Martin（）描述的方法进行消毒。
肝素（无防腐剂)、硫酸链霉素和青霉素（钾盐）、DEAE-葡聚糖(DEAE-D；平均分子量为2×)，其它所有化学品均为试剂级或现有最高纯度。
培养基和血清。Dulbecco用青霉素（国际单位（i.u.）/毫升）和链霉素（0.1毫克/毫升）改良了Eagle的最小必需培养基（以下简称DME；Dulbecco和Freeman，）。在含40％猪血清的DME中培养白细胞，在含10％小牛血清的DME中培养VERO细胞。
猪和小牛血清取自流动实验室（FlowLaboratories）。还从猪血中制备了猪血清，并通过硝酸纤维素膜；孔径nm）过滤消毒。
猪白细胞的纯化。将猪血（毫升）收集在装有肝素（40i.u./ml）、青霉素（i.u./ml）和链霉素（0.1mg/ml）的无菌玻璃瓶中。混合后，将血液倒入长方形玻璃容器（2厘米深×5.5厘米宽×10厘米高），并倾斜约45°。在37℃下放置30至60分钟后，大多数红细胞已沉淀，将上层相收集在一起，与3倍体积的磷酸盐缓冲盐水（PBS）和20i.u./ml肝素混合，并在室温下通过低速离心收集细胞。再次用含有肝素的PBS清洗细胞三次，在4至5毫升含5%猪血清的冰冻PBS中再悬浮，加入0.25体积含有20i.u./ml肝素和5％猪血清的0.15M-NH4CI、0.1mM-EDTA、0.01m-KHCO3、pH7-4（Roos和Loos，）。4°C下悬浮3到4分钟后，在4℃下离心收集白细胞。在含有5%猪血清和20i.u./ml肝素的的DME中离心两次，以去除红细胞血影，并将沉淀物在60毫升含有40%猪血清和10i.u./ml肝素的DME中再悬浮。每毫升典型制剂含有约20×白细胞，其中单核细胞占6%。这些数值相当于原血沉棕黄层中白细胞产量的40%。
细胞培养。使用μlHamilton微量注射器和自动分液器，向微量I平板的每个孔中加入10微升纯化白细胞悬浮液（制备方法如前所述），在平板中得到单核细胞培养物。合上培养板，并在37°C含5%二氧化碳的气体环境中培养。1至2天后，用针头去除培养基和未贴壁的细胞（主要是淋巴细胞和退化的粒细胞），并按照前述方法立即向每个孔中加入10微升在37℃下预热的新鲜培养基。贴壁细胞在1～2天内分化为巨噬细胞样细胞，可供感染ASF病毒。
为了在培养皿中培养单核细胞，将按上述方法制备的1ml纯化白细胞（20×白细胞；1-2×单核细胞）用1毫升含有40%猪血清的DME稀释，并将混合物添加到一个35毫米塑料培养板中。在37℃下于含有5%二氧化碳的气体环境中放置2天，然后去除含未贴壁细胞的培养基，加入新鲜培养基。一天后，贴壁细胞已分化为巨噬细胞样细胞，可供感染ASF病毒。
在含有10%小牛血清的DME塑料培养板中培养VERO细胞。
病毒。这些研究中使用的原始ASF病毒是年从西班牙巴达霍斯的一只受感染猪只的脾脏中分离出来的。迄今为止，该病毒已在猪单核细胞中传代约次，但本文报告的大多数实验都是使用第40次传代后的病毒。
病毒滴度以每毫升血细胞吸附单位（H.A.D.U.）或噬斑形成单位（p.f.u.）表示。
ASF病毒（在猪单核细胞传代36次）在VERO细胞上的适应性生长按以下感染程序进行：用1.1×H.A.D.U.ASF病毒培养含有2-3×细胞的60毫米塑料培养板。在37℃下吸附两小时后，将5毫升含有2%小牛血清的DME加入塑料培养板，并在37℃下培养一周，培养三天后更换培养基。第七天用胰蛋白酶去除贴壁细胞，并将其重新悬浮在含有与培养第三天和第七天后去除的培养基等量的混合物中再悬浮，浓度为1×细胞/毫升。将1毫升该悬浮液的样品加入到含有1×未感染细胞/板的几个板中的每一个板中。培养一周后再次对细胞单层进行胰蛋白酶化，重复多次，直到出现明显的致细胞病变效应（c.p.e.）。
微量血细胞吸附试验。微量试验I板中巨噬细胞样细胞培养物按前述方法制备。去除培养基后，用微升Hamilton微量注射器和重复分液器，从浓度较低的稀释液开始，向6-12孔含40%猪血清的DME中各接种2微升病毒稀释液。在37℃、5%二氧化碳环境下培养24小时后，从接种较低浓度的病毒稀释液的孔开始，用微升Hamilton微量注射器和重复分液器，向每孔含40%猪血清DME中加入10微升猪红细胞（个细胞）。进一步培养2到3天后，用倒置显微镜（尼康)以倍的放大倍数观察每孔中的血细胞吸附情况。病毒滴度根据Reed和Muench（)）所述方法确定。
菌斑试验。VERO细胞在含有含10%小牛血清的DME的60毫米塑料培养板中生长至汇合，在37℃下用PBS洗涤这些VERO细胞，并接种0.4毫升病毒稀释液，在含有2%小牛血清的DME中进行。在37°C下放置2小时后，每隔15分钟倾斜培养板，每个培养板加入9毫升含有2%小牛血清、0.7%（w/v）的DifcoagarNoble琼脂和每毫升80微克DEAE-D（DEAE葡聚糖）的DME，保持温度为42°C。室温下凝固20分钟后，在37°C和10%二氧化碳环境中培养平板。10天后，在每块平板如前所述不含DEAE-D的培养基中的0.5%（w/v）DifcoagarNoble琼脂中加入3ml浓度为10微克/毫升的中性红。18小时后对菌斑进行评分。
结果
ASF病毒的微量血细胞吸附试验
将纯化的白细胞悬浮液加入微量试验I板的孔后两到三天，一些细胞附着在塑料板上并分化成巨噬细胞样细胞。通过接种10微升白细胞悬液（2×白细胞和1×单核细胞），分化为巨噬细胞样细胞的贴壁细胞的平均数量为3x细胞/孔。如果洗涤过的贴壁细胞培养物感染了ASF病毒，细胞在一到两天后显示出圆缩、脱落和溶解的明显细胞病变。在感染的培养物中加入猪红细胞后，通过观察是否出现血细胞吸附花结，更容易检测出感染。在感染后（p.i.）12至18小时，一些花结已经出现，48小时后，每孔的花结数量非常多（超过个），甚至在只接种了5H.A.D.U.的孔中也是如此。
将每份稀释液分在6个孔中，每孔含10微升病毒稀释液，这样做，微量测试可检测到的最小病毒剂量约为40H.A.D.U./毫升。为了确定试验的复现性，使用从不同动物获得的白细胞制备塑料平板，所有这些白细胞都感染了相同稀释度的同一批ASF病毒。得到的平均值和标准偏差为3.8±0.4×H.A.D.U./毫升。使用2微升稀释液接种各孔，每份不同批病毒的稀释液分为12孔，这样做，可检测到的最小病毒剂量和微量试验的复现性分别为H.A.D.U./毫升和2.4±0.2×H.A.D.U./毫升。
为了检验微量测试中ASF病毒感染的反应是否符合泊松分布，将两块微量测试I板的个孔以不同的感染复数（m.o.i.）进行感染，并对感染孔的频率进行评分。图1（a）所示的结果表明，试验值确实与得出的泊松分布理论曲线非常吻合。
图1根据方程式得出的稀释液计数的剂量-反应曲线，其中P和S分别是受感染和未受感染的孔的频率，s是每孔病毒平均数量，n是产生感染所需的颗粒数（RobbMartin，）。
为了测试感染是否由单个病毒颗粒产生，测定了未感染孔的频率与每个孔的感染颗粒平均数。图1（b）所示的结果表明，感染可能是由单个感染性颗粒引起的。
使用与前述相同的ASF病毒和白细胞，将ASF病毒的微量试验与传统试验方法进行了比较，传统的试验方法使用莱顿管和血沉棕黄层（Hess和DeTray，；Malmquist和Hay，）。结果表明（如图2所示），两种试验方法下的最终滴度是相同的，但使用微量试验时，感染培养物达到最大反应的时间更快（感染后3天）。
ASF病毒在VERO细胞中生长的适应性
用猪巨噬细胞样细胞中传代36次的ASF病毒感染VERO细胞。如在“方法”中所述，每周对感染细胞进行传代培养。在第8次传代培养后，细胞出现脱落和圆缩，这种效果在随后的传代中更为明显。第11次传代后，细胞单层在感染4天后表现出强烈的细胞病变，细胞病变达90%以上。此时，将细胞重新悬浮在培养基中进行超声处理，低速离心澄清后，用上清液感染新的培养物。在第一次传代中，病毒滴度持续下降，直到第4次传代，然后滴度开始增加，直到第8次传代。在此之后，培养基中的病毒滴度范围为-H.A.D.U./毫升，与平均产量（10-H.A.D.U./细胞）一致。
使用在VERO细胞中传代23次的ASF病毒感染猪单核细胞。在单核细胞中传代两次后，感染病毒的适应性VERO的滴度与未通过单核细胞传代的VERO细胞适应性病毒的滴度相似。
ASF病毒的噬斑试验
适应在VERO中生长的ASF病毒在该细胞系汇合培养物上形成噬斑。在接种克隆病毒后第10天，菌斑平均直径约为1毫米。图3显示了病毒剂量和斑块计数之间的线性关系，表明每个斑块是由单个感染性颗粒产生的。有关菌斑试验最佳条件的研究表明，接种物中存在DEAE-葡聚糖并不影响最终滴定值，但当DEAE-葡聚糖（80微克/毫升）存在于覆盖层中时，滴定值增加了约3倍。同样的ASF病毒经血细胞吸附微量试验和菌斑试验滴定后，分别得到1.5±0.2×H.A.D.U./毫升和1.5±0.1×p.f.u./毫升。在使用巴氏移液管吸出各菌斑，在1毫升含2%小牛血清的DME中再悬浮，并冷冻和解冻两次，所得每块菌斑的平均p.f.u.（菌斑形成单位）数量为3.2±0.2×。
ASF病毒滴定
图2.ASF病毒的血细胞吸附微量试验(?一?)和标准试验方法(○—○)的比较。在图中所示的时间，对每份稀释液在6根莱顿管和微量试验I板的12个孔中的情况进行血细胞吸附评分，并根据Reed和Muench（）的方法计算滴度。
图3ASF病毒剂量与菌斑数量的关系。
讨论
通常的ASF病毒血细胞吸附试验需要大量猪血沉棕黄层。因此，我们开发了一个精细标准化的微量试验，使用纯化的猪贴壁白细胞群和微量试验I板代替血沉棕黄层和莱顿管。
本文所述的微量技术只需要少量的猪白细胞，感染细胞的反应比标准试验方法的反应快（图2）。病毒群的剂量-反应曲线十分符合泊松分布，表明感染可能由单个感染性颗粒产生。
Hess()曾报道过两种ASF病毒分离株在VERO细胞中生长的适应性，但没有对该细胞系进行噬斑试验的描述。在此我们描述了病毒分离株对该细胞系的适应性，首先将病毒在猪白细胞中传代数次。在VERO细胞中传代8次后，得到的病毒滴度为-H.A.D.U./毫升。适应性病毒在猪白细胞中很容易生长，在白细胞中传代两次后，在VERO细胞中仍能产生较高的病毒滴度。
Parker和Plowright()研究表明，用PK细胞感染了两者之一的细胞适应的ASF病毒后也能形成噬斑反应。噬斑试验呈现线性的剂量-反应曲线，菌斑大小不均一。菌斑试验方法的灵敏度是用旋转培养法测定的c.p.e.的50%终点估计值的10倍左右，但未与血细胞吸附微量试验的灵敏度进行比较。在本研究中，在猪单核细胞中克隆细胞培养适应性ASF病毒分离株，接种后第10天在VERO细胞中产生平均直径约1毫米的菌斑。剂量-反应曲线也是线性的，同批病毒的滴度比较表明，菌斑试验与血细胞吸附微量试验一样灵敏。
接种3天后，Tessier等人（)在VERO细胞上检测到细胞培养适应性ASF病毒的荧光斑块。虽然这种检测方法的灵敏度比血细胞吸附试验低5倍左右，但对于快速滴定细胞培养适应性ASF病毒非常方便。