生殖道感染与不孕不育密切相关，以非淋菌性尿道炎最为常见，主要是支原体和衣原体感染[1]而男性生殖道感染是影响男性生殖健康的一个重要因素，据报道约15%的男性不育与其有关［2］。支原体与衣原体导致的非淋菌性尿道炎在男性如生殖道、附睾、前列腺和睾丸相应感染部位较多［3］，对精液质量、精子发生、精卵结合及妊娠结局等方面有一定影响,而随着临床上对支原体和衣原体的检测方法一直不断的改进，由于扩增的方法不同，RNA检测的拷贝数大于DNA检测，使得其灵敏度更高,可以使临床更特异,更精准地早期检出［4］。
本文综述了近期的实验方法的研究进展。
[关键词]
衣原体,支原体，分子诊断,荧光定量PCR
一、流行病学和一般性机理
生殖道的支原体（mycoplasma）和衣原体(chlamydia）感染作为最常见的性传播疾病（sexuallytransmitteddisease，STD）之一，统称为非淋菌性尿道炎(nongonococcalurethritis，NGU)。生殖道支原体、衣原体感染导致不孕不育的发生得到大部分学者认可,但感染者大部份患者并无症状[5-6]。流行病学调查发现，亚洲地区国家中，生殖道支原体感染在伊朗的流行率较高，印度为6．0%，越南比较少仅为0.8%;在欧洲，流行率在1.1%-7.1%［7-9］.在中国，Zhang等在对深圳市人群的流行病学调查中发现，生殖道衣原体的总流行率为17.7%，而在过去3个月的性行为中没有持续使用避孕套和有其他性传播疾病的人，其感染率大大增高［10］。除此之外，研究指出，当生育期的男性生殖道感染支原体、衣原体时，会对男性精子造成影响，使精子发生液化时间延长，精子质量下降，导致男性不育症的发生。
男性精浆中感染UU时，通过干扰精子发生、影响精子代谢等多方面对精子造成影响，对精卵结合及生殖道局部免疫状况产生一定程度改变[11-13]。由于UU没有完整细胞壁结构，感染机体后并不进入组织和血液，而是寄生在生殖道粘膜细胞或生殖细胞上，靠汲取所寄生的细胞获取营养。被粘附的生殖道上皮细胞，吸收营养后细胞功能紊乱，精子生成的内环境失衡，生精作用受影响，精子生成数量减少。当UU粘附在精子头部和体部时，吸收精子细胞的营养物质，对精子的生成与代谢产生干扰作用，并造成精子运动能力降低.还可使精子的流线型线条产生改变[14]。国内外有很多研究结论指出，生殖道CT感染也是男性不育的因素之一[15],其感染引起的炎症作用(会产生炎症因子，细菌、白细胞)与致炎症因子共同相户作用对精子发生与成熟(会影响精子发育，导致精子密度减低，活力减小)的均带来负面影响[16]。有研究指出，CT的感染比UU感染对精子质量参数的影响更严重，尤其是在两者混合感染的患者中[17]。CT感染男性泌尿生殖道后，其感染代谢产生大量磷脂酶A2，分解精液中的花生四烯酸产生前列腺素，引起炎症反应，导致尿道炎、附睾炎、睾丸炎等[18]。CT可进入精子细胞内，使精子膜和顶体膜破坏，使精子的活动能力下降，并抑制精子对卵细胞透明带的附着与穿透，使受精作用减弱，降低男性的生育能力（精子活力）.
二、分子生物学方法
衣原体分子生物学方法
PCR法技术灵敏性高，有研究发现，PCR的特异性达到99％-％，然而，也有报告由于“残留（carryover）”污染而造成PCR假阳性，或因标本中含有Taq酶抑制物质而使PCR假阴性[19]。因而，PCR操作过程应严格防止污染，实验人员需具备熟练的分子生物学操作技术，最好在条件较为成熟的实验室开展，每次标本DNA提取及每批PCR扩增都应设阴、阳性模板对照，防止假阳性和假阴性。PCR技术不但能检测尿道或宫颈拭子标本，而且可以采用尿标本进行检测。但尿中可能存在扩增的抑制物，从而影响PCR的敏感性。Verkooyen等[20]报道将标本进行预先的加热处理或使用二磷酸蔗糖（2SP）转运培养基可显著降低AMPLICORCtPCR对抑制因子的易感性。将临床标本加热处理后10倍稀释亦可在很大程度上防止这种抑制。
衣原体核酸检测核酸杂交是最先开展的分子生物学技术，其检测CT特异性DNA或RNA序列，敏感性和特异性分别为70%-92%和97%-98%［21］。核酸扩增技术(nucleicacidamplificationtests，NAATs)大多基于PCR，使用荧光标记探针实时检测，可以扩增和检测出CT特异性DNA或RNA序列，检测灵敏度高于90%，特异性大于99%。NAATs可用于尿液标本和自取阴道拭子的检测，不依赖于活的病原体，标本采集及运输便利。因此美国食品和药物管理局(FDA)批准将NAATs检测用于CT感染的筛查或诊断［22］。但NAATs所需实验设备与试剂仍较昂贵，为降低NAATs的成本，研究者将多个尿液、宫颈拭子或阴道拭子标本汇集后进行NAATs检测，如汇集标本为阳性，再分别检测每个标本，如为阴性则无需分别检测［23-24］。并且现有证据表明10个尿液标本汇集检测不会丧失任何敏感性或特异性，同时成本节省40%-60%［23］。但是NAATs仍然不能完全取代CT培养法，NAATs没有被FDA批准用于衣原体药敏试验及治疗效果评估。因为经抗生素治疗后杀灭的衣原体中残留的核酸可能在治疗后3周内仍呈阳性［25］。
支原体分子生物学方法
支原体感染主要表现为异常分泌物、性交后出血、轻微尿频等非淋菌性尿道炎及生殖道炎症状，多无典型临床表现，不易被发现，主要诊断依据为实验室检查结果。实验室检测主要包括分离培养法、血清学检查和分子生物学方法。目前，DNA探针及PCＲ技术得到了广泛应用，较培养法更敏感、特异、快速，对临床诊断有价值。
采用实时荧光定量PCＲ(RT-PCR)技术对3年生殖道标本进行CT、NG、UU病原体DNA检测，UU标本例(男例，女例)，总阳性率54.2%(/)。其中，男性患者阳性标本例，男性患者阳性检出率37.3%(/)，女性患者阳性标本例，女性患者阳性检出率64.1%(/),检出率准确较高〔26〕。
近期，.张欠欠等作者采用由中山医科大学安达基因诊断中心提供检测试剂盒实时荧光定量聚合酶链式反应技术(FQ-PCＲ)检测标本中的NG-DNA、CT-DNA和UU-DNA。，研究结果显示，从年至年，3种病原体感染率呈逐年上升趋势，其总阳性检出率61.96%，单一感染模式高于混合感染模式〔27〕.AmirmozafariN等[28]对例患者的阴道分泌物进行支原体检测，采用培养法共检测出阳性患者83例，其中MG阳性23例(11%)、UU阳性69例(32.9%)，利用PCR法检测支原体阳性患者共例(57.1%)，其中MG阳性28例(13.3%)、UU阳性67例(31.9%)、二者共同感染25例(11.9%)。两种检测方法相比，显示PCＲ检测较培养法具有更高的敏感性。越来越多的证据表明:相对于传统PCＲ，多重PCR检测法更具优势。有研究[29]指出:多重PCＲ对UU的检测灵敏度高于80%，特异性和敏感性接近%。DiazN等[30]利用多重聚合酶链反应(M－PCＲ)技术及常规培养法对例女性患者的阴道分泌物进行检测，发现M－PCＲ的敏感性及特异性均较培养法高，差异有统计学意义。SamraZ等[31]采取M－PCＲ对例性传播疾病(STD)患者的阴道分泌物进行检测，检测了6种可能的致病菌，其中包括CT、MH、MG、NG、TV、UU，检出率与培养法及PCＲ检出率进行比较，M－PCＲ对沙眼衣原体、支原体、MG、淋球菌、阴道毛滴虫和98%的UU敏感，特异性范围为97%～%。可以看出M－PCＲ具有高度敏感性的优势，而且可以从一个标本中检测到多种致病菌[32]。
荧光定量PCR:荧光定量PCR也称实时定量PCR,它集PCR和DNA探针杂交技术的优点为一体,直接探测PCR过程中的荧光变化获得DNA模板的准确定量结果（国内相对成熟的比如中山达安基因公司生产的试剂盒）[33]。整个过程在闭管状态下进行,不需要进行电泳或放射自显影,操作简便快捷,解决了传统PCR易出现产物污染导致的假阳性问题。Yoshida等首先建立了TaqMan实时PCR定量检测Mg的方法,进行Mg含量与支原体对泌尿生殖道致病性之间关系的研究[34]。他们选用引物Myins/MGSO-2扩增16SrRNA上-位序列,设计的TaqMan探针位于-位其间。同时将包含目的片段的一段bp的序列克隆到T载体,定量后作为外标准用于样本的定量。结果特异性良好,除Mg以外的其他任何支原体无非特异性扩增产物。检测灵敏度达到10拷贝,线形范围在-拷贝之间。因此认为实时PCR能够敏感地定量尿道炎和无症状男性首段尿标本中的Mg。Jensen等[35]设计了基于MgPa基因的探针和引物扩增MgPa基因-位78bp序列。由于该区域G+C含量低,他们采用了一种新型的TaqManMGB探针。这种探针的3′端标记的是不发光的淬灭基团,然后连上MGB基团。MGB可以显著提高异源双链的稳定性,提高探针的Tm值,从而使探针的长度可以大大缩短,由于探针报告基团与淬灭基团的距离较短及在结构上具有其他更有效淬灭荧光的因素,反应的背景值更低。Jensen等[35]设计的MgPa-探针仅由18个碱基组成,结果可以检测到小于5拷贝的Mg,与其他支原体没有交叉反应。Jensen还采用了内标共扩增定量法,其优点是可以排除管间扩增效率不同所致的差异。而且对比实验表明TaqmanPCR比普通PCR更少受反应体系中可能存在的抑制物的影响。Blaylock等[36]还设计了针对gyr基因的引物,同时体系中扩增人HEp-2细胞RNase基因作为非竞争性内标准定量。反应同样获得良好的特异性和重复性.通过荧光定量ＰＣＲ方法检测病原体ＤＮＡ具有特异性高，操作简便，检测周期短及可定量等优势。在很大程度上克服了传统的如涂片法，培养法，免疫法等敏感性差。可靠性低，检测周期长等缺点。为临床及时有效地判断病情提供了便利[35].近期多数文献报道实验所用ＣＴ和ＵＵ－ＤＮＡ检测试剂盒均购自中山大学达安基因股份有限公司，实验所用仪器为美国ＡＢＩ公司７５００荧光定量ＰＣＲ仪[37-38].
三、结语
支,衣原体对泌尿生殖系统有各种危害，由于感染后常无明显症状，未能接受有效药物治疗，使感染持续存在，导致感染蔓延，因此,有效可靠的检测方法和临床诊断标准是非常必需的。通常把培养作为微生物感染诊断的金标准,但由于培养所需时间长,不能快速诊断,而且阳性率低,因此不宜用于常规检测。PCR快速、敏感,广泛用于Mg的致病性和流行病学研究,通常同时用几对引物筛选确认排除假阳性,但应该注意可能存在的假阴性因素。荧光定量PCR技术较普通PCR敏感性好,特异性高,具有良好的发展前景。但在实际应用时，医院和患者的具体情况选取合适的检测方法。
作者：
刘康生1茅晓东2潘锋3陈亚军1
单位：
1.南京医院（医院）实验诊断科
2.医院内分泌科江苏南京
四、参考文献
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