乙脑病毒（Japaneseencephalitisvirus，JEV）属于黄病毒科黄病毒属，是通过蚊虫进行传播的虫媒病毒。JEV引起的乙型脑炎致死致残率高，我国是乙脑的高发区，曾一度占世界总发病人数的80%。目前JEV疫苗的使用在一定程度上减少了乙脑的发病率，但对于已发病的患者，仍然没有针对性的特效药或治疗手段，寻找治疗JEV感染的特效药物是目前刻不容缓的任务。
年8月16日，JournalofVirology在线发表了来自中国科学院武汉病毒研究所王薇团队题为《ScreeningofFDA-ApprovedDrugsforInhibitorsagainstJapaneseEncephalitisVirusInfection》的研究成果。研究团队通过对美国FDA批准的种药物的筛选获得了5种对JEV的治疗指数大于10的小分子药物，证实了5种FDA批准药物在体内和体外均能有效抑制JEV感染，基于其明确的作用靶点，高效的病毒抑制率以及良好的生物相容性，为研发高效的可用于临床治疗JEV和黄病毒科感染的药物奠定了基础。
研究背景日本脑炎病毒(JEV)是一种节肢动物传播的黄病毒，是人类急性病毒性脑炎的主要病因，目前尚无批准的药物可用于JEV特异性治疗，疫苗对所有临床JEV毒株也都没有效果。通过对已批准药物进行抗病毒效果研究，将有可能发掘药物的新用途将加速治疗战略的发展。
主要结果1、FDA药物批准库中的高通量抗JEV的药物筛选与效果验证
（1）高通量药物筛选：首先，研究者使用带有荧光素酶报告基因的JEV感染性克隆，对美国FDA批准的种药物的进行了3论筛选，获得5种对JEV的筛选指数（SelectIndex,SI，CC50/IC50）10的小分子药物，分别是马尼地平、西尼地平、盐酸贝尼地平、吡美莫司和奈非那韦。前3种药物属于电压门控型钙离子通道抑制剂，吡美莫司常用于皮肤消炎，奈非那韦是艾滋病毒蛋白酶抑制剂（图1）。
Figure1:ScreeningforInhibitorsofJEVInfectionfromanFDA-ApprovedLibrary
（2）量-效关系研究：研究者在Vero细胞中使用0.2MOI的JEV感染性克隆与5种药物不同浓度进行了体外抗病毒效果验证，显著的量-效关系进一步证实了物种药物的抗病毒效果（图2）。
Figure2:Validationtheantiviraleffectofthehitdrugs
（3）作用时间研究：通过在JEV感染性克隆病毒感染Vero细胞前后不同时间点加入五种药物10um后荧光素酶的读值比较分析，确定这5种药物均作用于JEV的复制阶段（图3A和3B）；在此基础上，进一步使用BHK-21细胞和不同浓度药物对JEV复制子的抑制效果进一步证实了作用时间与量效关系（图3C），10um药物效尤其明显。
Figure3:Time-of-additionanalysisofthehitdrugsantiviralactivity
（4）抗病毒作用谱研究：通过将5种药物不同浓度分别与黄病毒科的寨卡病毒（ZIKV）、登革病毒（DENV-2）、西尼罗病毒（WNV）各0.2MOI进行抗病毒效果研究，发现这5种药物对黄病毒科病毒均具有广谱抗病毒效应（图4）。
Figure4:Broadspectrumantiviralactivityofthehitdrugsagainstflaviviruses
（5）抗病毒作用机制探讨：鉴于5种药物中有3种均为钙离子抑制剂，研究者在Vero细胞和Huh7细胞中使用了另外4种钙抑制剂进行研究（Verapamil,2-APB,CyclosporinA,BAPTA-AM），明确细胞内钙离子在JEV感染中发挥重要作用（图5）。
Figure5:Theinhibitoryeffectoffourkindsofcalciuminhibitors
2、体内抗病毒作用靶点研究
为了了解钙离子通道抑制剂的体内抗病毒作用靶点，研究人员重点考察了其中一种钙离子通道抑制剂马尼地平的抗病毒作用机制。通过使用5um和10um药物筛选压力下进行病毒传代培养，并对野生型病毒和适应性突变株P20代病毒进行序列比对，发现马尼地平的病毒靶点是位于JEV跨膜区3非结构蛋白NS4B的位谷酰胺（Q）。Q突变成正电氨基酸精氨酸（R）或赖氨酸（K）后，突变病毒对马尼地平不敏感；而Q突变成负电氨基酸谷氨酸（E）则不影响对马尼地平的敏感性（图6）。
Figure6:Selectionandcharacterizationofmanidipine-resistantJEVBroadspectrum
3、体内抗病毒效果研究
为了进一步考察马尼地平在体内对JEV的抗病毒作用，研究者使用5×pfu剂量JEV感染Balb/C小鼠，25mg/kg的马尼地平一天给药两次进行治疗，通过对小鼠的存活率以及感染后1、3天的脑、肾、血液中的病毒RNA，以及第5、21天额组织病理进行分析，结果发现给药能显着降低小鼠的死亡，马尼地平通过抑制中枢神经系统中JEV的感染增殖，减轻JEV对脑组织的病理破坏发挥治疗作用（图7）。
Figure7:ManidipineprotectedmicefromJEVinfection
小结本研究得到了国家自然科学基金项目的资助，第一作者为博士汪少伯，通讯作者为副研究员王薇。研究通过对美国FDA批准的种药物的筛选获得了5种对JEV的治疗指数大于10的小分子药物，证实了5种FDA批准药物在体内和体外均能有效抑制JEV感染，特别是钙抑制剂，鉴于其明确的作用靶点，高效的病毒抑制率以及良好的生物相容性，为研发高效的可用于临床治疗JEV和黄病毒科感染的药物奠定了基础。
ABSTRACTJapaneseencephalitisvirus(JEV),anarthropod-borneflavivirus,isamajorcauseofacuteviralencephalitisinhumans.ThereisnoapproveddrugavailableforJEV-specifictreatment,andthevaccinesarenoteffectiveagainstallclinicalJEVisolates.Herein,ahigh-throughputscreeningwasperformedagainstJEVfromanFDA-approveddruglibrary.FivehitdrugswereidentifiedthatinhibitedJEVinfectionwithaselectiveindex10.Antiviralactivitiesofthesefivehitdrugsagainstotherflavivirus,includingZikavirus,werealsovalidated.Asthreeofthefivehitdrugswerecalciuminhibitors,additionaltypesofcalciuminhibitorswereutilizedthatconfirmedcalciumwasessentialforJEVinfection,mostlikelyduringviralreplication.AdaptivemutantanalysisuncoveredthatreplacementofQ,locatedintransmembranedomain3ofthenon-structuralNS4Bproteinwhilerelativelyconservedinflavivirus,withRorKconferredJEVresistancetomanidipine,avoltage-gatedCa2+channel(VGCC)inhibitor,withoutapparentlossoftheviralgrowthprofile.Furthermore,manidipinewasindicatedtoprotectmiceagainstJEV-inducedlethalitybydecreasingviralloadinbrain,whileabrogatinghistopathologicalchangesassociatedwithJEVinfection.Thisstudyprovidedfiveanti-flaviviruscandidatesandidentifiedcytoplasmiccalciumasanovelantiviraltargetfortreatmentofJEVinfection.Thefindingsreportedhereprovidetherapeuticpossibilitiesfor