前两次我们已经系统地对慢病毒和腺相关病毒包装步骤进行描述，如果您细心阅读或者做过病毒包装，您就会发现这里有一个关键环节还没进行描述。
就像新的化合物合成以后需要通过高效液相色谱（HPLC）检测纯度一样，病毒包装后的效力如何，如何定量，也是必须要检测的。专业术语称为：病毒滴度的测定。
病毒滴度是衡量病毒颗粒量的多少，是对病毒进行评价的单位。测量病毒滴度对于病毒使用以及进行感染细胞是至关重要的，一方面对每次包装出的病毒进行定量，对包装效率进行评价；另外一方面在摸索感染复数的过程中，减少不必要的病毒的浪费，并评价病毒使用过程中对细胞是否存在毒害作用。
对于慢病毒和腺相关病毒，均可以通过实时定量PCR、依赖于报告基因的GFP荧光检测、嘌呤霉素筛选及物理法等手段检测滴度。由于病毒外壳蛋白的不同，可以通过抗原抗体反应检测慢病毒特有的p24外壳蛋白，即ELISA法，而腺相关病毒携带β-半乳糖苷酶基因，可将腺相关病毒感染细胞后X-gal染色计数，测定腺相关病毒的滴度。
另外可以通过检测慢病毒中逆转录酶的活性来测定慢病毒的滴度。物理法测定病毒滴度：病毒颗粒数（VP）法，VP法是利用OD检测病毒颗粒数，比较简单但在某些情况下却很实用方便，缺点为定量不够精确，存在一定程度的误差。
以下将三种常见的，腺相关病毒和慢病毒均适用的测定方法进行介绍。
1.荧光定量PCR法测定滴度
定义：
实时荧光定量PCR技术可直接测定病毒核酸的含量，是目前测定病毒滴度的最准确方法，具有对模板进行准确定量等特点，敏感性通常高达拷贝/ml，且线性范围宽；操作简单，耗时短，重复性好，结果相当稳定。缺点为只能间接反映病毒的感染力。
实验步骤：
检测按Takara公司SYBRGreen荧光定量试剂盒要求将病毒核酸及质粒标准品分别加样，每个样品均设3复孔。反应体系为：SYBR?PremixExTaqTM(2×)12.5ul，PCRForwardPrimer（10umol/L）1ul，PCRReversePrimer（10umol/L）1ul，ROXTM(ReferenceDyeorDyeII*3（50×）0.4ul，template2ul，ddH2O8.1ul，总体系25ul。
阴性对照组以ddH2O代替待测样品。AglientMX型荧光定量PCR仪进行扩增。反应条件为：95℃10min，1个循环；95℃1min、55℃1min、72℃1min，40个循环；95℃15s、60℃1min、95℃15s，1个循环。荧光染料的发光强度在反应过程中自动采集，反应结束后机器自动生成标准曲线。
根据CT值制作散点图，并添加趋势线，将待测样品的CT值带入公式X*10-6(ug/ml)/Y(g/mol)*6.23×mol，X为稀释前的DNA浓度，单位为ug/ml，Y为待测样品相对分子质量，单位为g/mol，计算后得到病毒滴度。所得结果即为对应病毒液中完整病毒基因组的拷贝数，单位为vg/ml。
病毒滴度测定标准曲线
2.荧光法测定滴度
定义：
进行载体构建时，加上标记基因如GFP，可对病毒感染细胞后进行直观的观察。以这种方式进行测定病毒，病毒的滴度单位为TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。TU为“transducingunits”的缩写，中文名称为“转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。
实验步骤：
Day1细胞准备：将生长状态良好的T细胞消化计数后稀释至5-细胞/ml，加入96孔板，μl/孔，每个病毒准备6个复孔。未种植细胞的孔加入μl的无菌PBS，放入37℃，5%CO2培养箱中培养。
Day2加病毒：在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。稀释方法如下：准备8个1.5mlEP管，每管加入90μl培养液，往第一个管中加入10μl病毒原液，混匀后，吸取10μl加入第二个管混匀。依此10倍梯度稀释至1E-8。
吸去96孔板中培养基60μl，加入含稀释好的病毒液10μl，并做好标记。
Day3追加培养液：在每个孔加入μl完全培养液。
Day5观察结果并计算滴度：在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个梯度有荧光的荧光细胞克隆平均数。假设倒数第二个病毒梯度平均有X个克隆和最后个梯度平均有Y个克隆，则滴度（TU/ml）=（X+Y*10）*Z*/2，Z为X个克隆病毒的稀释倍数。比如稀释1E-6浓度梯度平均有22个荧光克隆，1E-7梯度平均有2个荧光克隆则病毒滴度为（22+2*10）*1E6*/2=2.1E9TU/ml
3.嘌呤霉素筛选测定滴度
定义：
构建载体时，设计加入嘌呤霉素抗性情况下，可将病毒感染细胞后，根据细胞的存活对病毒进行滴度的测定。包括两个方面的内容：首先对待测细胞进行嘌呤霉素浓度的摸索，得到一个最佳的嘌呤霉素的浓度，其次进行梯度稀释病毒后测定病毒滴度。该方法使用也较广泛，但由于实际操作或者细胞状态等原因，测量结果会有一定的误差。
实验步骤：
嘌呤霉素浓度筛选接种细胞于24孔板中，过夜培养，至细胞长至30%-50%时，按不同浓度的嘌呤霉素加入孔板中，留4孔加入等量无菌三蒸水作为阴性对照。48h后，观察细胞死亡情况，得出使细胞全部死亡的最小浓度，即嘌呤霉素对该细胞的最小致死浓度。
稀释病毒测定滴度接种细胞于24孔板中，过夜培养，至细胞长至70%-80%时，冰上融化病毒，按~的稀释倍数进行梯度稀释后加入各孔板中，每个浓度设置复孔，并做阴性对照。
48h后，换成含嘌呤霉素的培养基（嘌呤霉素浓度为预实验筛选出的浓度），48h后，观察孔板中细胞全部死亡孔对应的最高病毒稀释倍数，该孔病毒的稀释倍数再除以加入病毒的体积，即病毒的滴度，单位为TU/ml，与使用荧光法测定的单位相同。
一个月过去了，有关病毒包装系列的实验就暂时告一段落了，相信大家一定收获不少吧，如果有任何问题或者建议请大家积极留言，下期我们会进行基因编辑系列讲座，请大家持续