庞继景教授
厦门大学附属厦门眼科中心
这几天，关于遗传性视网膜疾病基因治疗的好消息，像北半球回归的春天一样，让人欣喜。由宾夕法尼亚大学塞缪尔·雅各布森博士领导的临床研究团队，在1/2期基因治疗临床试验中，观察到前3例Leber先天性黑蒙1型(LCA1)患者，在使用包含GUCY2D正常基因的腺相关病毒5型载体药物治疗后视力有所改善。该治疗也显示了良好的安全性。春天的回归走了一条漫长的路，由南向北次第展开。然而和星辰的轮转相比，对于科学的探索，却如此不同，它虽然也有一定的规律，但你却不能准确地预测出何时才能抵达彼岸，更不知前面还有多少未知。我很幸运，能成为其中的早期参与者和见证者之一。Leber先天性黑矇(Lebercongenitalamaurosis，LCA)是发病早而且较为严重的遗传性视网膜病变，全世界患病率为1／—1／，约占遗传性视网膜变性类疾病的5％，占儿童先天性双眼盲的10％～20％。德国眼科医师TheodorLeber于年首先报道了该病。
目前，临床上只要发现出生后患儿有不追物、压眼征及眼球震颤三联征，就可以初步诊断为LCA，并对患儿进行ERG检查。如果有明显的ERG异常，则可临床诊断为LCA，并进一步做基因检测确定致病基因和最后的基因诊断，为将来的基因治疗做好准备。一般认为，LCA呈常染色体隐性遗传，也有少数病患呈常染色体显性遗传的报道。目前已确定27种LCA的致病基因，这些基因突变患者占总数的的70％以上，另外还有20％～30％的LCA患者致病基因尚不清楚。其中Leber先天性黑矇1型（LCA1）是由GUCY2D基因突变导致。GUCY2D基因突变可导致早期和严重的视力损害或失明。LCA1是LCA中最常见的一种形式，约有10-20%的LCA患者属于LCA1。GUCY2D基因位于人染色体17p13.1,其编码产物是鸟苷酸环化酶1(retGCl)，GC1是一跨膜蛋白，此蛋白特异性地在视网膜视锥、视杆细胞的细胞核及内节中表达。当GUCY2D基因突变后，相当于在感光细胞发育阶段给予其持续光刺激,从而导致类似光持续照射的情况使光感受器凋亡。GUCY2D基因突变患者临床上多表现为视功能严重损害，畏光明显，但眼底大致正常。除LCA1外，GUCY2D基因在临床上也可导致锥-杆营养不良6型(CORD6)。
在先天性黑矇中，LCA1致病基因GUCY2D是第一个被确认的。LCA1的病变除了影响和暗处视力相关的视杆细胞以外，对和白天视力相关的视锥细胞影响更大。LCA1患者的临床表现各异，早期既不像RP患者一样单纯表现为杆细胞功能障碍导致的夜盲，也和锥细胞功能完全丧失表现为昼盲的全色盲不完全一样。这类患者，虽然主要表现为畏光等视锥细胞障碍，但即使在早期也有不同程度的杆细胞功能障碍，即轻度夜盲。我们知道，小鸡和一般的鸟类在黑暗中或光线较弱的地方看不清东西。这是因为鸡的视网膜光感受器中占主导地位的，是在白天起作用的视锥细胞，没有多少晚间视物所用的视杆细胞，因此小鸡是天生的夜盲。因此夜盲症民间也俗称雀盲眼。GUCYl*B基因缺陷小鸡和因GUCY2D基因缺陷造成的LCA1患者一样，都是因相应基因突变造成视网膜特异性蛋白聚糖环化酶GCl缺乏导致的。所以在二十多年前，这个出生后就完全失明的小鸡模型被认为是研究LCA1较好的动物模型之一。
一位在佛罗里达大学神经科学部任教的女教授，一开始也用具有相关突变的这种小鸡作为研究的动物模型。经过多年的研究，也取得了一些进展，但是因为小鸡模型和人的差距、还有相关cDNA的克隆、AAV载体转染效率、特别是视网膜下腔给药等一系列不确定性，一直没有明显的突破，也使当时做这个项目的一个女博士生感到很迷茫。年7月，当我转入佛罗里达大学眼科后，用一年的时间建立了小鼠给药的平台，可以一次视网膜下腔注射转染全部视网膜，消除了给药成功与否的不确定性，为鉴定载体是否有效提供了保证，为基因治疗的快速推进奠定了基础。
我建立的小鼠视网膜下腔注射技术中，生后0-4天小鼠的视网膜下腔注射技术是根据基因治疗的先驱之一JeanBenett的丈夫，宾大眼科的视网膜手术专家，也是LCA2-RPE临床试验最早的术者之一，AlbertM.Maguire教我的方法，进行修改、演变而来的；而成熟小鼠的视网膜下腔注射技术就是根据当时佛罗里达大学眼科Timmers博士的大鼠视网膜下腔注射技术演变而来。后来我又根据自己的经验建立了一套更难却更有效的生后14天小鼠的视网膜下腔注射方法，极大地提高了基因治疗的效率。年,我在美国眼科及视觉研究（ARVO）大会上，首次公布了早期AAV5-RPE65基因疗法，可以在自然产生的具有RPE65缺失的rd12小鼠中完全恢复其生理功能、视功能和视行为。也就是在这个时期，视锥细胞只占不到5%的小鼠模型基本上成为研究人类视网膜遗传病的常规动物模型。有公司已经将每个基因都做了相关敲除和胚胎冷藏，一般半年多时间就可以通过恢复冷藏胚胎的方法得到相关的基因敲除小鼠种群。在这种情况下，能够加快研发速度、更接近人类LCA1的GC1基因敲除小鼠模型就不可避免地面世了。延续了当时对LCA1患者和其小鸡模型的理解，这个GC1敲除小鼠也是只有最主要的视锥细胞中蛋白聚糖环化酶1（GC1）的功能丧失。视杆细胞可能因为有GC2的存在，并没有受到太大影响；这也是LCA发病机理中有必要继续研究的地方。因为虽然GC1的缺失对LCA1的发病起决定性作用，但是主要在视杆细胞中起作用的GC2对LCA1中视锥细胞的功能到底有多大的作用，那时还不是特别清楚，对是否对LCA1基因治疗的策略和最终结果产生影响也不是特别清楚。当时这位女博士生找到了我，提出用我的治疗方法试验一下GC1敲除小鼠模型的基因治疗。我当时立刻同意，并马上给她注射了几只当时仅有的三周龄小鼠。没想到，很快就发现注射后的模式小鼠视锥细胞中的病理改变就被纠正过来。虽然当时第一次治疗后的视锥细胞功能并没有明显恢复，但是理论和写作水平超强的她随后写出了第一篇相关文章并顺利通过答辩，获得了博士学位。毕业后她进入我们眼科开始做博士后。她的导师就是Timmers教授，一个不久前从欧洲移民过来的典型科学家：在大是大非问题上敢于坚持真理和公平正义；对人善良，非常愿意助人，是很多年轻学生心中的榜样。
在她两年的博士后研究快要结束时，她的导师因故离开了佛罗里达大学，她也转到了我们视网膜遗传病基因治疗实验室。这时，我根据我的成功经验，帮助她设计了LCA1-GC1的P4早期基因治疗新方案，并很快证明治疗后的小鼠确实恢复了视锥细胞的视功能和视行为。这期间她和我们实验室一个对载体设计极具天赋的小伙子结了婚，形成了理论和技术的完美结合。以后他们共同改进载体设计，提高转染效率，完善动物模型，为LCA1的临床试验奠定了基础。后来赛诺菲决定投资这项LCA1的基因治疗药物研究，并做了相关商业化部署。但是由于赛诺菲这种国际性的跨国公司主要精力集中在常见病的药物开发，而不在眼科基因治疗，使临床试验的进展相对较慢。于是这对夫妻和其他人士一起成立了AtsenaTherapeutics。年7月29日，赛诺菲决定把LCA1的知识产权转让给了AtsenaTherapeutics。并在年12月19日，赛诺菲的SofinnovaInvestments带领抗盲基金会（FFB）等多家投资公司向Atsena投资万美元继续进行LCA1的基因治疗临床试验。该公司随即加速开展LCA1的临床I/II期基因治疗试验。
佛罗里达大学眼科年Faculty合影。我的左右两侧这对夫妻就是AtsenaTherapeutics公司的创建者。年4月10日，在ISCIENCE线上发表的预览文章中，报道了LCA1临床试验的最新进展：前三名注射药物的患者都是患有重度视力障碍的成年人，都有眼球震颤，但仍残留一些视细胞结构。三人都接受了最低剂量的治疗，并取得了一定的疗效。因为LCA1患者的突变情况不同，生活环境和习惯也不同，所以三名受试成年患者的病变程度也不同。第一名患者治疗前最重，治疗前只有光感；其黄斑中心凹处视锥细胞已消失很久，但黄斑周围仍有比较完整的视杆细胞。对这个患者的视网膜下腔注射虽然是在黄斑附近，但主要是想要转染治疗黄斑周围的视杆细胞。治疗后至少九个月内，视杆细胞功能是有所改善的。第二名患者的视力治疗前最好，有1.25logMAR；黄斑中心凹处仍残存少量视锥细胞；其周围细胞仍然比较完整。对这个患者的视网膜上方进行视网膜下腔注射后，因注射处没有视锥细胞，所以预计只会出现视杆细胞功能的恢复。但是由于可能的技术原因，这个患者注射到视网膜下腔的治疗载体量较少，这个患者虽然其视杆细胞功能也有所改善，但改善程度不如第一个患者明显。全视野灵敏度检测是一种适合于病变晚期、病情进展严重患者的视力检查方法，能够检查并提供周边视觉和暗环境下视觉反应的视杆细胞功能。第一位和第二位接受治疗患者的全视野灵敏度检测显示：视杆细胞功能都有所改善。第三名患者的的视力较好，有1.27logMAR（约等于中国视力表的0.05）；特别是其黄斑中心凹处视锥细胞厚度基本正常。对这个患者的黄斑处进行视网膜下腔注射后，其视力在九个月内有了明显的改善；从治疗前的1.27logMAR，提高到治疗后的0.92logMAR（约等于中国视力表的0.12）；至少-0.3logMAR的视力提告，相当于提高了ETDRS视力表的3行（多看了15个字母）。这个结果显示第三位患者的中心视力，也可以说视锥细胞的功能应该得到了改善；此患者的视杆细胞功能也有所改善，可能和同时转染了部分黄斑周围的视杆细胞有关。LCA1的基因治疗特点是治疗前残留的视细胞，尤其是视锥细胞越多，治疗效果越好。希望广大患儿家长提前对患儿进行眼部保护性干预，延缓视细胞，特别是视锥细胞的凋亡速度，为将来获得较好的基因治疗效果保留一个机会。为了使广大LCA1患者能尽量科学地保护好眼睛，养成良好的用眼卫生习惯，有条件的患者应尽量争取每年前来复查一次，并进行个性化保护眼睛的咨询，为将来的基因治疗提前做好各项准备。
（来源：庞继景遗传咨询）
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